バイオものづくりを支える微生物探索のための基盤技術を開発

ミリオンスクリーニングには、ドロップレット内における微生物の増殖や目的とする生産物を検出する技術の開発が必要です。微生物の増殖を検出するには、細胞の自家蛍光あるいは細胞外分泌物と反応する試薬を使用して発光させる方法があります。しかし、自家蛍光の強度では検出感度が得られず、細胞外分泌物を検出する手法では、周辺環境などから持ち込まれた細胞外物質による偽陽性やバックグラウンドの上昇が問題となっていました。

研究の経緯

産総研は、微生物を活用したバイオものづくり研究を推進しており、ミリオンスクリーニングの基盤技術を開発してきました。今回、この技術を高度化し、かつ適用範囲の広い基盤技術として、微生物の膜を特異的に染色する蛍光試薬を用いたドロップレット内の微生物増殖を検出する技術を開発しました。この検出法は、バックグラウンドの上昇を抑え、生きている細胞を高感度に捉えます。

なお、本研究開発は、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）の委託事業「カーボンリサイクル実現を加速するバイオ由来製品生産技術の開発事業、（通称：バイオものづくりプロジェクト）」（2020～2026年度）」による支援を受けています。

研究の内容

ドロップレット培養スクリーニング技術は、ミリオンスクリーニング技術の基盤であり、微生物をドロップレット内で液体培養した後、蛍光・散乱光などの検出に基づく陽性ドロップレットの選択的分取を行います。本研究はこの技術を発展させ、微生物の膜を特異的に染色する蛍光試薬を用いて、培地成分の影響などによる偽陽性を抑えて高感度に微生物の増殖を検出する技術を開発しました。この新規技術は、細胞を毒性少なく直接染色するため、微生物の増殖を直接捉えられるのが特徴です。また、微生物の数の増加に伴い、微生物の膜の総量も増加することから、膜の染色で微生物の存在量(数)を指標に選抜・分取できる新規の技術です。

まず、マイクロ流路を用いてオイルの中に水相のドロップレットを生成させました。その際、膜に結合すると蛍光強度が増大する膜染色試薬を培地とともにドロップレット内に封入しました。これにより、ドロップレット内部で細菌が増殖した時の蛍光強度の増大を検出できるかどうかを検討しました。作製したドロップレットを37℃で一晩静置培養後、顕微鏡で観察すると大腸菌が増殖したドロップレットが強く蛍光を発する様子が観察されました（図１）。