【鳥取大学×東京薬科大学】ヒト染色体領域のクローニングを飛躍的に改善する技術を開発～マウス人工染色体を用いたヒトゲノム研究・創薬研究を加速～

＜参考図解説＞
図1　本研究成果概要
（A）ヒト染色体をMAC上に搭載するために従来用いられる方法。1,正常ヒト細胞の染色体に薬剤耐性遺伝子で標識し、2,ヒト染色体とマウスA9ハイブリッドを作製したあと、3,MMCTによって単一のヒト染色体を別の細胞へ移したライブリを作製する。その後、4,単離されたヒト染色体をDT40細胞へと移し、５,相同組換えによってヒト染色体領域にLoxP配列を挿入する。6,MACを持つCHO細胞へと改変した染色体を移入し、7,Creを発現させることでMACとヒト染色体を転座させる。（B）本研究において確立した新規なMACへのヒト染色体搭載方法。1,CRISPR/Cas9を用いてヒトiPS細胞の任意染色体に薬剤耐性遺伝子を挿入し、2,MMCTによってMACを持つCHO細胞へと導入する。3,CHO細胞内のヒト染色体とCRISPR/Cas9によって染色体転座を引き起こす。

図2　ヒトiPS細胞からCHO細胞へと移入された6番染色体
（A）上段：ゲノム編集によって薬剤耐性遺伝子と赤色蛍光(mCherry)遺伝子を6番染色体に挿入されたヒトiPS細胞。下段：ヒトiPS細胞の染色体解析(FISH)像。矢印及び拡大像は、HLA-A遺伝子が赤色で、挿入された薬剤耐性遺伝子が緑色で染色されている6番染色体を示す。（B）上段：MMCTによってヒトiPS細胞から6番染色体を導入されたMAC保持CHO細胞のコロニー。6番染色体上に挿入された遺伝子によって薬剤耐性と赤色蛍光が付与されている。下段：6番染色体を導入されたCHO細胞の染色体解析(FISH)像。矢印及び拡大像は、HLA-A遺伝子が赤色で、挿入された薬剤耐性遺伝子が緑色で染色されている6番染色体を示す。CHO細胞の中に、HLA遺伝子と挿入遺伝子で標識されたヒト6番染色体が存在していることを示す。

図3　ゲノム編集によるヒト染色体とMACの転座
（A）ヒト6番染色体とMACが部位特異的に転座した後に生じるDNAのPCR検出結果。Cas9とgRNA複合体を導入した後のゲノムDNA10-100µg中で転座DNAが検出された。ゲノムDNA10µgはCHO細胞1500個分相当であるため、転座が最低1/1500の頻度で発生することを示す。（B）クローン化した転座DNAを持つ細胞の染色体解析(FISH)像。ヒト染色体が赤色で、マウス染色体(MAC)が緑色で染色体されている。矢印と拡大図は、ヒト6番染色体短腕部がMACに搭載された転座染色体と、短腕部を欠失して短縮した6番染色体を示す。