【鳥取大学×東京薬科大学】ヒト染色体領域のクローニングを飛躍的に改善する技術を開発～マウス人工染色体を用いたヒトゲノム研究・創薬研究を加速～

しかしながら、MACへヒト染色体を搭載する工程は、非常に複雑かつ時間が掛かるため、新たなTCマウスを作製する際のボトルネックでした。この工程は、任意のヒト染色体を単離する工程と、ヒト染色体をMACへと転座させる工程の2点に分けられます。ヒト染色体の単離は、目的の細胞へ染色体を導入する技術であるMMCTを用いる必要があります。しかし、MMCTの染色体ドナーには無限増殖能が必須であるのに対し、正常ヒト細胞は限られた回数しか増殖できないため、染色体ドナーとして利用できませんでした。そのため、従来はヒト染色体を取得するために、無限増殖可能なマウスA9細胞と正常ヒト細胞を融合し、無限増殖能を獲得したハイブリッドをヒト染色体ドナーとして利用してきました。また、単離したヒト染色体は相同組換えによって部位特異的な改変が可能なニワトリDT40細胞へと移入し、LoxP配列を挿入されていました。改変されたヒト染色体は、最終的にMACを持つ細胞へと移入され、MAC上とヒト染色体上にそれぞれ存在するLoxP配列間をCre酵素の発現によって組換えることで、MAC上にヒト染色体が転座されてきました。本研究グループは、正常に近い染色体を持ちながら無限増殖できるヒトiPS細胞を染色体ドナーに利用する新規技術と、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を利用した部位特異的な染色体切断の応用によって、上記工程の短縮を試みました。

＜研究の内容＞
MMCTは、染色体ドナーとなる細胞に対して単一または少数の染色体を持つ微小核を形成させ、細胞膜を伴って脱核させることにより微小核細胞を取得し、任意の受容側細胞と融合することによって染色体を導入する技術です。これまで従来のドナー細胞の微小核形成には微小管阻害剤であるコルセミド等が利用されてきましたが、ヒトiPS細胞の微小核形成に有効な薬剤は知られていませんでした。そこで本研究グループが近年報告した、パクリタキセルとリバーシンという2種の薬剤の組み合わせによる微小核形成法をヒトiPS細胞に対して応用し、微小核形成を誘導可能な条件を決定しました。また、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術によって、ヒトiPS細胞の6番染色体または21番染色体上に薬剤耐性遺伝子を挿入して標識し、ヒト染色体ドナー化しました。さらに、決定された微小核形成条件と標識染色体を持つヒトiPS細胞をドナーとして用いてMMCTを実施することにより、ヒト6番染色体と21番染色体をそれぞれ、MACを保持するCHO細胞へと導入することに成功しました（図2A）。これはヒトiPS細胞の染色体を直接別の細胞へと導入した世界で初めての事例です。これにより、ヒト正常細胞とマウスA9細胞のハイブリッドを作製する工程、及びハイブリッドから任意ヒト染色体を単離する工程が不要となりました。